我国首个完全自主开发的原创型基因治疗载体
2021-01-08 08:28:43
1月5日，上海交通大学系统生物医学研究院的蔡宇伽团队在《自然-生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering）杂志上发表了一篇题为：Lentiviral delivery of co-packaged Cas9 mRNA and a Vegfa-targeting guide RNA prevents wet age-related macular degeneration in mice的研究论文，发明了一种介于病毒载体与非病毒载体之间的类病毒体（virus-like particle, VLP）递送技术。VLP可以递送CRISPR/Cas9 mRNA, 实现安全和高效的体内基因编辑。值得一提的是，该技术是我国首个完全自主开发的原创型基因治疗载体，体现了我国在基因治疗领域的科技进步。
自最早的基因编辑工具问世至今，基因编辑技术已经有近30年的历史了。特别是2012年以来，随着CRISPR的横空出世，基因编辑技术日渐趋于成熟。然而遗憾的是，相对于基因编辑工具本身的快速进化，其递送技术的发展极其缓慢和困难。而递送之于基因编辑治疗的重要性如同火箭之于登月。由于递送技术的滞后发展，体内基因编辑治疗的临床应用困难重重，整个领域都在期待递送技术的突破。
诺奖得主Jennifer Doudna在2020年初给Nature杂志撰写的综述中，系统论述了基因编辑治疗的前景和挑战。在展望CRISPR美好应用前景的同时，这位今年的诺奖得主发出了‘递送可能仍然是基因编辑体细胞治疗的最大瓶颈’的感叹（Delivery remains perhaps the biggest bottleneck to somatic-cell genome editing）。
近几年来，基因编辑工具本身的发展令人眼花缭乱，各种Cas9变体、碱基编辑工具及其变体、Prime Editor等，层出不穷。但是，这些工具的临床应用必须回归到递送，而迄今为止可选的递送工具还是有几十年历史的‘老三件’：AAV、慢病毒以及纳米材料。尽管这些递送载体广泛用于基础研究，但它们却不适合直接用于临床。基因编辑的临床应用有着安全性和有效性的双重标准。一方面，病毒载体由于长时间的表达基因编辑酶，会带来安全性上的不确定性；另一方面，纳米材料则面临效率上的挑战。2020年上半年，张峰作为创始人的著名基因编辑治疗科技型企业Editas实施了首例人体基因编辑治疗的临床研究(Nature Biotechnology volume 38, page382(2020))。但由于该研究使用AAV作为载体，CRISPR将长期与患者共存，具有一定的风险。理想的基因编辑递送工具需要兼具瞬时和高效的特点，以确保治疗的安全性和有效性。
慢病毒载体可以高效感染几乎所有的细胞，而非病毒成分mRNA具有瞬时性的特点。蔡宇伽团队利用mRNA茎环结构与噬菌体衣壳蛋白特异识别的原理，通过病毒工程技术，将两者的优点完美的结合起来，创造了新型递送技术VLP-mRNA。通过VLP-mRNA递送Cas9 mRNA, Cas9的存在时间只有72小时。研究发现，与长时间表达Cas9的病毒系统相比，VLP mRNA可以显著降低、甚至完全避免脱靶效应。另外，VLP mRNA可以递送整个CRISPR元件（Cas9与gRNA）,克服了AAV载体运载能力小的限制，甚至可以递送更大的碱基编辑工具。
蔡宇伽团队研究人员还将VLP-mRNA技术用于眼科疾病的治疗。老年性黄斑变性（AMD）是一种退行性眼底疾病。患者表现为中心视力下降、视物变形、周边部或中心视野出现暗点,对老年人的生活 质量造成极大的影响。据统计,西方发达国家中 70 岁 以上的老年人罹患 AMD 者超过 40%。随着我国老年人口日渐增多,黄斑变性的发病率也越来越高。另外，糖尿病患者也可能罹糖尿病相关黄斑变性，总体发病率在10%左右。目前，黄斑变性的治疗方法是VEGF单克隆抗体。然而，抗体需要反复给药；另外，抗体外溢可导致严重的并发症。
蔡宇伽团队研究人员还将VLP-mRNA技术用于眼科疾病的治疗。老年性黄斑变性（AMD）是一种退行性眼底疾病。患者表现为中心视力下降、视物变形、周边部或中心视野出现暗点,对老年人的生活 质量造成极大的影响。据统计,西方发达国家中 70 岁 以上的老年人罹患 AMD 者超过 40%。随着我国老年人口日渐增多,黄斑变性的发病率也越来越高。另外，糖尿病患者也可能罹糖尿病相关黄斑变性，总体发病率在10%左右。目前，黄斑变性的治疗方法是VEGF单克隆抗体。然而，抗体需要反复给药；另外，抗体外溢可导致严重的并发症。
研究团队利用激光诱导的小鼠黄斑变性模型，通过视网膜下腔注射的方式，发现CRISPR特异性的分布在视网膜色素上皮细胞（RPE），而RPE 细胞是眼内VEGF的主要来源。VLP递送CRISPR实现了高达44%的vegfa基因敲除，降低了63%的新生血管面积。第二代测序表明VLP-mRNA未诱导出脱靶效应。对于此前报道的AAV递送CRISPR引起的大片段缺失，研究团队通过第三代测序，仅能发现勉强高于背景的信号。值得一提的是，VLP mRNA无论在体外还是在眼内，均未引起免疫反应。这些实验结果有力支持了CRISPR在黄斑变性基因治疗上的临床应用潜力。
总的来说，VLP-mRNA是一种通用型的、瞬时性的CRISPR递送工具，兼具高效和安全的优点。该技术无疑将帮助CRISPR体内基因编辑治疗时代的真正来临，为无药可治或有药难治的遗传性、获得性以及感染性疾病的患者带来新的希望。上海交通大学博士生凌思凯是本文的第一作者，上海交通大学附属第一人民医院眼科临床医学中心的杨仕琪博士、孙晓东教授也为本研究的完成做出了重要贡献。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院、瑞金医院、中科院、丹麦奥胡斯大学的科学家参与了该研究。（文/上海交大）
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